медицинский каталог




Кожные и венерические болезни. Руководство для врачей. Том 4

Автор Ю.К.Скрипкин (ред.)

рдио-липиновым антигеном, причем при всех формах сифилиса (как до, так и после специфического лечения) специфичность несколько ниже. В. Н. Беднова и соавт. (1985) обследовали 541 больного в разных стадиях сифилитической инфекции — до и в процессе лечения — и получили положительные результаты в MP в 94% случаев, а в РСК с кардиолипиновым антигеном — в 92,9% случаев. По результатам исследований, проведенных Н. М. Овчинниковым и соавт. (1983), среди 466 лиц, свободных от сифилитической инфекции, в MP зарегистрировано 0,8% неспецифических результатов, в РСК с кардиолипиновым антигеном — 0,6%.

В настоящее время используется высококачественный стандартный кардиолипиновый антиген. Методика постановки MP хорошо отработана. Вместе с тем качество постановки этой реакции имеет большое значение. Ее постановку не следует доверять недостаточно обученному персоналу. G. D. Wasley (1985) для повышения качества серологических исследований считает необходимой организацию внутрилабораторного контроля, так как достоверность результатов обеспечивается безупречной техникой постановки реакций.

К ошибочным результатам при постановке MP приводят неправильное хранение антигена и сывороток крови, бактериальное их загрязнение, исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности слабоположительной; неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием; применение при постановке реакции загрязненных пипеток, пробирок, панелей, растворов.

Методика постановки MP с отечественными ингредиентами. Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты: антиген кардиолипиновый; холин-хлорид (включается в упаковку с антигеном); натрия хлорид, натрий лимонно-кислый (цитрат натрия) трехзамещенный (ЫазСбШО? * 5НгО); мертиолат (C9H902SNaHg).

Растворы: изотонический раствор натрия хлорида 0,9%, раствор холин-хлорида 10%.

Раствор готовят следующим образом. К 29,65 мл изотонического раствора натрия хлорида добавляют 0,35 мл 0,01% раствора мер-тиолата и 5 мл 70% раствора холин-хлорида. Смесь тщательно перемешивают. При отсутствии мертиолата для приготовления 10% раствора холин-хлорида необходимо к 30 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида добавить 5 мл 70% раствор холин-хлорида. Раствор стойкий; при отсутствии бактериального загрязнения он может храниться в течение 10—12 мес при температуре 4°С.

Раствор трехзамещенного цитрата натрия 5% готовят на дистиллированной воде, затем фильтруют. При помутнении его необходимо заменять свежим. Хранят раствор в холодильнике при температуре 4 °С в течение 5—6 дней.

Контрольные лиофилизированные сыворотки крови используют неразведенными. Слабоположительную сыворотку получают из положительной путем разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена. В день постановки реакции положительную сыворотку крови титруют на пластинке для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня в качестве контроля.

Титрование проводят следующим образом. В 9 лунок пластинки, начиная со 2-й лунки, вносят по 3 капли изотонического раствора натрия хлорида; затем добавляют в 1-ю и 2-ю лунки по 3 капли положительной сыворотки крови. Содержимое 2-й лунки перемешивают пастеровской пипеткой, «насасывая» и выпуская его в лунку 5—б раз. Затем набирают часть содержимого 2-й лунки в пастеровскую пипетку и 3 капли переносят в 3-ю лунку, а оставшуюся сыворотку крови возвращают во 2-ю лунку. Содержимое 3-й лунки перемешивают таким же образом, 3 капли переносят в 4-ю лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки 3 капли удаляют. Во все лунки добавляют по одной капле эмульсии кардио-липинового антигена. Пластинку встряхивают ручным способом или в аппарате для встряхивания в течение 5 мин, добавляют по 3 капли изотонического раствора натрия хлорида и оставляют при комнатной температуре на 5 мин, после чего регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (+/2+), используют в качестве слабоположительного контроля. Для получения его делают соответствующее разведение.

При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения наблюдается равномерное уменьшение величины хлопьев преципитата.

При снижении реактивности хранящейся контрольной сыворотки крови используют разведение, дающее слабоположительный результат при повторном титровании. Контрольную сыворотку крови можно использовать до тех пор, пока она дает положительный результат (Mil) в разведении не ниже 1:2 и слабоположительный результат (++) в разведении не ниже 1:4. При дальнейшем снижении реактивности положительную контрольную сыворотку крови заменяют новой.

Во время хранения контрольных сывороток крови не допускаются повторные замораживания и оттаивания, так как в этом случае реактивность их снижается.

О снижении реактивности контрольной сыворотки крови, а не эмульсии антигена судят по параллельному титрованию этой сыворотки крови с использованием хранившейся и вновь приготовленной эмульсии. Если получают один и тот же титр антител в MP с обеими антигенными эмульсиями, то считают, что снижение реактивности зависит от условий хранения контрольной сыворотки крови. Если снижение реактивности наблюдают только при использовании хранившейся эмульсии антигена, то это обусловлено снижением реактивности эмульсии антигена. Эмульсию необходимо заменить свежеприготовленной.

Эмульсию кардиолипинового антигена готовят из специального кардиолипинового антигена для микрореакции преципитации.

Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на прозрачность ампулированного антигена. При выпадении кристаллов холестерина их растворяют нагреванием ампул в термостате или на водяной бане при температуре 37 или 56 °С соответственно.

Прежде чем приготовить эмульсию, рассчитывают необходимое количество ее на рабочий день или рабочую неделю (на 50 исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена). В пробирку сухой пипеткой вносят не более 2 мл антигена, добавляя его к равному объему 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 мин, затем центрифугируют (1000 об/мин) до получения прозрачной надосадочной жидкости, которую удаляют, а к осадку добавляют 3,5 объема (по отношению к взятому антигену) 10% раствора холин-хлорида. Пробирку плотно закрывают пробкой, ее содержимое взбалтывают до полного ресуспендирования, опрокидывая пробирку. Полученная эмульсия готова к употреблению. Если необходимо получить большое количество эмульсии, ее готовят не в одном флаконе большой емкости, а в нескольких пробирках, внося в каждую из них по 2 мл антигена.

Эмульсию антигена хранят в холодильнике при температуре 4 °С не более 1 нед, а при добавлении раствора мертиолата — в течение 2 нед. В день постановки реакции необходимое для данного рабочего дня количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для согревания при комнатной температуре на 30 мин и проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови. Проверяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув пробирки черной бумагой. Пригодность каждой новой серии антигена проверяют в экспресс-методе одновременно с уже бывшей в работе серией на заведомо положительных и отрицательных сыворотках крови. О пригодности антигена судят по величине титров, наблюдаемых при одновременном титровании положительных сывороток крови с новой и проверенной сериями антигенов. Получение близких результатов, т. е. величин титров реагинов, различающихся на ± 1 разведение, одинаковой выраженности хлопьев преципитатов, наблюдаемых в одних и тех же разведениях положительных сывороток крови, а также отсутствие преципитата в отрицательной сыворотке крови свидетельствуют о пригодности исследуемой серии антигена. Серию антигена бракуют, если одновременное титрование контрольной положительной сыворотки крови с новой серией антигена показывает: а) слабовыраженный преципитат (++; +) при минимальных разведениях сыворотки крови; б) более низкий (на 2—3 разведения) титр реагинов, чем с употреблявшейся проверенной серией; в) наличие преципитата в отрицательных сыворотках крови.

Для получения плазмы крови кровь берут из пальца так же, как и для исследования СОЭ. При этом смачивают капилляр аппарата Панченкова 5% раствором натрия цитрата и набирают раствор до метки «К», возвращают раствор во флакон до метки «25»,

а оставшийся цитрат выливают в центрифужную пробирку, куда затем вносят 3 капилляра крови, взятой из флакона до метки «К», перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а в экстренных случаях центрифугируют для получения плазмы, которую отсасывают пастеровской пипеткой для проведения исследования.

Для получения инактивированной сыворотки крови кровь берут из вены, получают сыворотку крови и инактивируют ее так же, как для РСК.

Методика постановки MP с плазмой и инактивированной сывороткой крови. Пастеровской пипеткой берут плазму или инак-тивированную сыворотку крови и вносят по 3 капли в лунки, куда затем добавляют по одной капле эмульсии кардиолипинового антигена. Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины в течение 5 мин, после чего в каждую лунку добавляют по 3 капли изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной температуре на 5 мин (оптимальный температурный режим 23—28 °С). Результаты учитывают только после появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке.

Результаты учитывают невооруженным глазом над искусственным источником освещения. В лунках с плазмой или сывороткой крови, взятых от больных сифилисом, выпадают различной величины хлопья. Появление крупных хлопьев расценивают как положительный результат (++++; +++), средней величины и мелких — как слабоположительный результат (++; +), В сомнительных случаях (±) необходимо ориентироваться на контроль отрицательной сыворотки крови.

Вместо количественной методики постановки РСК с кардиоли-пиновым антигеном при

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Кожные и венерические болезни. Руководство для врачей. Том 4" (5.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]


Химический каталог Rambler's Top100

Copyright © 2009
(21.11.2018)