медицинский каталог




Кожные и венерические болезни. Руководство для врачей. Том 4

Автор Ю.К.Скрипкин (ред.)

а материала из уретры и канала шейки матки по Романовскому — Гимзе. Цитологические методы используют для диагностики острых конъюнктивитов взрослых и новорожденных; менее пригодны они для выявления инфекции мочеполового тракта. Диагностировать хлам ид и иную инфекцию с помощью данного метода удается в среднем лишь у 15% мужчин и 40% женщин, особенно при заборе материала из канала шейки матки.

Цитологическое исследование окрашенных препаратов

Для идентификации хламидии, если нет возможности использовать серологические и культуральные методы, исследуют препараты, окрашенные по методу Романовского — Гимзы.

Реактивы: 1) метанол химически чистый или ацетон; 2) краска Романовского — Гимзы; 3) этиловый спирт 96%.

Препарат высушивают на воздухе, фиксируют метанолом или ацетоном. На сухой препарат наносят краску Романовского — Гимзы на 45 мин в разведении 1:10 (1 часть краски и 9 частей фосфатного буфера). Препарат промывают проточной водой и просушивают.

При окраске препаратов по методу Романовского — Гимзы элементарные тельца хламидии окрашиваются в розовый цвет, а ретикулярные тела — от голубого до синего. Ядра клеток имеют вишневый оттенок, цитоплазма нежно-голубая, цвет включений варьирует.

Для совершенствования диагностики урогенитального хламидиоза были предложены иммуноферментные и иммунофлюоресцентные методы. Они, так же как и самый надежный культуральный метод диагностики, требуют специального оборудования и реактивов. Серологические методы рассматриваются как дополнительные.

В практике серологических исследований одной из первых применили реакцию связывания комплемента с групповым антигеном, реагирующим с антителами С. trachomatis, С. psittaci. Более перспективная серологическая реакция — микроиммунофлюоресценция (МИФ). В настоящее время широко применяются иммунофермен-тный анализ (ELISA) и выявление хламидии в соскобах с использованием моноклональных антител, меченных флюоресцеин-изоти-оцианатом, а также поликлональных противохламидийных антител.

Клинические испытания для экспресс-диагностики урогенитального хламидиоза реагента фирмы «Орион-диагностика» (Chlamyset) показали, что метод прямой иммунофлюоресценции технически прост, чувствителен, специфичен и воспроизводим.

Исследования на хламидии иммунофлюоресцентным методом с использованием моноклональных антител

Материал помещают на предметное стекло, равномерно распределяя тонким слоем на площади не более 8 мм. Стекла затем высушивают на воздухе.

Фиксация материала осуществляется безводным ацетоном, метанолом или этанолом методом нанесения их на препарат в количестве 2—3 капель или путем погружения препарата в раствор фиксатора на 30 с. После фиксации препарат вновь высушивают на воздухе. Хранить или транспортировать препараты следует при комнатной температуре (в сухом месте). Обрабатывать их можно в течение 7 дней, контрольные препараты можно хранить до 1 мес и более.

Окраска препарата моноклональными антителами. 1. Приготовление реагентов. Лиофилизированные моноклональные антитела, меченные флюоресцеин-изотиоцианатом и содержащие краситель Эванса голубой, разводят в 1 мл 0,1% водного раствора азида натрия. В этом растворе реагент может сохраняться до 12 нед, если соблюдаются условия хранения (в темном месте при температуре 4—8°С ).

2. Нанесение реагента на препарат. С помощью автоматической пипетки наносят 30 мкм реагента на участок предметного стекла диаметром 8 мм, на котором находится материал для исследования. Перед нанесением реагента рекомендуется убедиться в наличии материала на стекле. С помощью наконечника пипетки или запаянной пастеровской пипетки равномерно распределяют реагент по всей поверхности зоны с материалом.

3. Инкубация препаратов. Препараты с нанесенным на них реагентом инкубируют во влажной камере при комнатной температуре, периодически проверяя их состояние во избежание высыхания реагента на препарате, что может привести к ложноположительной диагностике. Инкубация производится при горизонтальном положении предметных стекол.

4. Промывание стекол. По истечении срока инкубации стекла тщательно промывают в дистиллированной воде не менее 10 с, остатки воды удаляют с краев стекла с помощью фильтровальной бумаги и высушивают стекла.

5. На препарат наносят 20 мкм забуференного глицерина (глицерин в 0,1 трис-буфере, рН 8,5).

6. Покрывают препарат обезжиренным покровным стеклом размером 22x40—60 мм № 1.

7. Просматривают препарат в люминесцентном микроскопе с системой фильтров, рассчитанных на выявление свечения флюорес-цеина-изотиоцианата (максимальная длина волны возбуждения 490 нм, средняя длина волны излучения 520 нм). Увеличение в 400—500 раз, а при необходимости уточнения деталей объекта — до 1000 раз с использованием нефлюоресцирующего иммерсионного масла.

Препарат рекомендуется просматривать сразу после приготовления. Если такой возможности нет, то смонтированные препараты можно хранить при температуре 2—8 °С не более 24 ч.

Высокая специфичность моноклональных антител позволяет диагностировать наличие элементарных тел хламидии, расположенных внеклеточно. Они представляются в виде ярко-зеленых округлых образований с ровными краями. Размеры их составляют Vioo от окружающих эпителиальных клеток. Можно наблюдать также и ретикулярные тельца, размеры которых в 4—5 раз больше элементарных. Внутриклеточные включения встречаются не более чем в 5% случаев. Любой флюоресцирующий материал неправильной формы или другого цвета, а также имеющий неяркую зеленую окраску рассматривается как артефакт. Следует помнить, что диагностику можно проводить только в том случае, если при просматривании препарата видны окрашенные в красный цвет эпителиальные клетки.

Диагноз считается положительным, согласно инструкции фирмы «Орион-диагностика», если в препарате удается обнаружить не менее 10 не вызывающих сомнения телец хламидии.

Отрицательным диагноз считается при наличии красных эпителиальных клеток, в то время как хламидии не определяются. Чтобы отрицательный диагноз можно было считать достоверным, рекомендуется просматривать все поля препарата не менее 3 мин.

Примечание. Реагент следует хранить при температуре 2—8 °С и перед применением держать при комнатной температуре ие менее 5 мин.

Лабораторная диагностика хламидиоза с использованием реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ)

Для постановки РНИФ вскрывают флакон препарата «Хлами-Скан» с куриными антителами к хламидиям (флакон № 1) и флакон с антителами к иммуноглобулинам курицы, меченными ФИТЦ (флакон № 2). Добавляют по 1 мл дистиллированной воды в каждый флакон и растворяют содержимое в течение 1—2 мин при комнатной температуре, слегка встряхивая флаконы. Растворенные реагенты хранят в темноте при температуре 2—8 °С в течение 10 сут. Допускается однократное замораживание.

Монтирующая жидкость — водно-глицериновая смесь готовится путем перемешивания 1 мл дистиллированной воды с 2 мл глицерина в отдельной пробирке или флаконе до получения однородного раствора. Для повышения яркости свечения меченных ФИТЦ объектов рекомендуется вместо дистиллированной воды использовать любой буферный раствор с рН 7—8,5. Хранят в закрытом виде при комнатной температуре.

1. На мазок микропипеткой наносят 30 мкл раствора из флакона № 1, стекло помещают во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре или в термостате при температуре 37 °С в течение 15 мин.

2. Стекло промывают в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

3. На мазок микропипсткой наносят 30 мкл раствора из флакона № 2, помещают стекло во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре или в термостате при температуре 37 °С 15 мин.

4. Стекло промывают, как описано в п. 2.

5. На высушенный мазок наносят каплю водно-глицериновой смеси, накрывают мазок покровным стеклом и микроскопируют в люминесцентном микроскопе или с люминесцентной насадкой к обычному оптическому микроскопу. Рекомендуется использовать масляную иммерсию с нефлюоресцирующим маслом или дибутим-либо диметилфтанатом, если изучение препарата производится с объективом МИ 90 и окуляром 4—7. Водно-иммерсионную систему применяют, если объективы ВИ 60—70 и окуляры 5—10;

Модификация прямого и непрямого иммунофлюоресцентного метода диагностики урогенитального хламидиоза

Ультраструктурный анализ показал, что элементарное тельце хламидии (инфекционная единица) представляет собой кристаллоид как следствие макромолекулярной упаковки ДНК. При изучении элементарных телец в люминесцентном микроскопе установлено, что перефокусировка приводит к возникновению по периферии элементарного тельца четкого дифракционного кольца (кольцо Фри-неля). Другие микроорганизмы, а также ретикулярное тельце хламидии дифракционного кольца не образуют. Этот дополнительный тест (дифракционное кольцо вокруг элементарного тельца) позволяет исключить артефакты, существенно упрощает диагностику, сокращает время исследования. Его достоверность не требует находки 10 элементарных телец в микроскопе. Диагноз считается положительным, если в препарате обнаруживают 2—3 элементарных тельца, образующих при фокусировке дифракционное кольцо.

Модификация реакции заключается в том, что на фиксированный препарат наносят 10 мкл реагента (противохламидийные антитела), стекло со вторым мазком и изучаемым фиксированным материалом кладут на каплю реагента первого препарата по типу покровного стекла. Реакция идет 15—20 мин при комнатной температуре и позволяет избежать использования влажной камеры. Увеличение времени инкубирования не приводит к ухудшению качества исследования. Разделение препаратов и промывание стекол производят в течение 30 с в проточной воде либо в емкости с дистиллированной водой. Разделение препаратов на воздухе недопустимо, так как моментальное подсыхание реагентов может способствовать утрате качества препаратов.

При прямом методе с использованием противохламидийных антител, меченных ФИТЦ, препарат готов к исследованию после высыхания. При непрямом методе после первых антител (противохламидийные кур

страница 46
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Кожные и венерические болезни. Руководство для врачей. Том 4" (5.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]


Химический каталог Rambler's Top100

Copyright © 2009
(19.11.2018)