медицинский каталог




Кожные и венерические болезни. Руководство для врачей. Том 4

Автор Ю.К.Скрипкин (ред.)

иные) на просушенный препарат наносят каплю второго реагента (при использовании препарата «Хлами-Скан» — противокури-ные антитела, меченные ФИТЦ). После промывки и просушивания препарат готов к исследованию. Сухой препарат может сохраняться в течение 1—2 дней в темном месте при температуре 4 °С.

Преимуществами данного метода являются простота, легкая воспроизводимость, достоверность, экономия реагентов. Наличие дифракционного кольца у исследуемых структур является дополнительным диагностическим тестом, позволяющим исключить ошибки диагностики.

Кожно-аллергическая проба

Общедоступным и легко воспроизводимым методом в качестве отборочного теста у больных с подозрением на урогенитальный хламидиоз считается кожно-аллергическая проба с хламидийным (ор-нитозным) аллергеном, разработанная И. О. Терских.

Внутрикожная проба: диагностик ум (аллерген) в объеме 0,1 мл вводят шприцем внутрикожно по средней линии внутренней поверхности правого предплечья, обработанной предварительно этиловым спиртом. Контрольный препарат вводят в левое предплечье. Результаты учитывают через 24 и 48 ч. Спустя 6 ч после введения диагностикума образуется красное пятно, которое полностью исчезает через 18 ч (контрольное введение). На месте введения специфического аллергена определяются красное пятно и инфильтрат, слегка возвышающийся над поверхностью кожи. Диаметр инфильтрата через 24 ч составляет от 0,5x0,5 до 3x4 см. Образование пятна и инфильтрата сопровождается иногда чувством жжения. Реакцию на внутрикожное введение специфического аллергена оценивают по 4-крестовой системе: инфильтрат размером 0,5x0,5 см — один крест (+), 1x1 см — два креста (++), а размером 2x3 см и более — 3 (+++) и 4 (++++) креста. Через 48—72 ч после появления инфильтрата реакция начинает «угасать», но нередко бывает выражена еще на 4—5-й день.

Изоляция возбудителя в культуре клеток

Согласно рекомендациям ВОЗ (1982), лучшим методом диагностики хламидийных поражений мочеполового тракта является изоляция возбудителя в культуре клеток, обработанных антиметаболитами. За рубежом в большинстве лабораторий используют культуру клеток Мак-Коя, обработанных циклогексимидом. Можно применять 5-йод-2-диоксиуридин, цитохалазин В, диэтиламиноэтин, декстран и ряд других реагентов. По мнению R. Evans и D. Taylor-Robinson (1979), лучшие результаты дает обработка клеток циклогексимидом.

А. А. Шаткин и соавт. (1981) отдают предпочтение методу диагностического выявления С. trachomatis в культуре клеток мышиных фибробластов (L=929), обработанных диэтиламиноэтин-декстра-ном.

На вероятность идентификации включений и выделений С. trachomatis в культуре клеток больных негонококковыми уретритами влияет ряд обстоятельств. Отдельные из этих положений необходимо учитывать и при других клинических формах урогенитального хла-мидиоза.

1. Состав группы. В некоторых исследованиях было установлено, что доля находок хламидии у мужчин с негонококковыми уретритами значительно ниже у гомосексуалистов, чем у гетеросексуалистов [Goldmeyer D., Darougan S., 1977; Bowie W. et al., 1978].

2. Прием антибиотиков. Во время подобных исследований необходимо исключить из обследуемого контингента лиц, которые принимали антимикробные средства (обычно за 1 мес до обследования), поскольку это может оказывать значительное влияние на вероятность выделения хламидии.

3. Длительность уретритов. S. Richmond и соавт. (1972), J. Oriel и соавт. (1976) отмечают, что у мужчин с негонококковыми уретритами, имевших соответствующие симптомы в течение 7 дней и более, хламидии выделяются значительно чаще, чем при более коротком течении заболевания.

4. Методы забора материала. Наибольшую долю положительных

результатов получают при использовании эндоуретральных кюреток

[DunlopE. et al., 1972].

5. Время между взятием образцов и нанесением материала иа

культуру клеток должно быть возможно более коротким. После

хранения образцов при температуре 4 °С в течение 24 ч вероятность

выделения хламидии резко снижается. Хранение при температуре —70 °С также вызывает снижение числа положительных находок

[Reeve P., OwenJ., 1975].

6. Чувствительность методики выделения зависит от применяемой линии клеток, предварительной обработки культуры клеток,

скорости центрифугирования клинического материала и температуры, при которой оно проводится, а также кратности сбора

образцов.

Материалы: 1) культура клеток Мак-Коя; 2) ростовая среда (среда Игла без глутамина — 400 мл, 3% раствор глутамина — 5 мл, эмбриональная сыворотка теленка — 4% от общего объема, гентамицин — 40 мкг/мл); 3) изолирующая среда (среда с антибиотиками для заражения клеток клиническим материалом) того же состава, что и ростовая, только эмбриональную сыворотку теленка берут в количестве 8% от общего объема и 5 мл 10% раствора глюкозы.

Транспортная среда (для забора и хранения клинического материала): готовят фосфатный буфер с сахарозой: сахарозы 48,46 г, К2НР04 (безводный) 2,088 г, КН2Р04 (безводный) 1,088 г.

Каждый компонент необходимо растворить в 60 мл дистиллированной воды, слить вместе и довести до 1 л. Проверить рН и при необходимости довести его с помощью НС1 или NaOH до 7,0; разлить по 48 мл в одинаковые объемы и автоклавировать при температуре 115 °С в течение 15 мин. Хранят при температуре 4 °С до применения в течение 1—2 мес.

Перед использованием к 48 мл указанного буферного раствора добавляют инактивированную нагреванием сыворотку крупного рогатого скота — 2 мл (4% от общего объема), стрептомицин — 50 мкг/мл и амфотерицин В — 25 мкг на 1 мл среды,

В качестве транспорной среды можно использовать также ростовую среду, в 99 мл которой вносят следующие добавки: 1 мл 5% раствора глюкозы, стрептомицин и амфотерицин В в конечной концентрации 50 и 25 мкг на 1 мл среды соответственно. Затем транспортную среду разливают стерильно в пенициллиновые флаконы с бусинками по 2 мл и хранят при температуре —20 °С в течение месяца.

Пассирование клеток Мак-Коя. В каждый матрас, предназначенный для пассирования, добавляют 4—5 мл среды роста, смачивают поверхность стекла средой и ставят на 10 мин в термостат при температуре 37 °С для уменьшения щелочности стекла. В это время подбирают клеточную культуру для пассирования, сливают прежнюю среду, добавляют 0,2% раствор версена и трипсина в соотношении 2:1 и удаляют этот раствор, как только визуально появятся «трещины» в клеточном монослое. Для прекращения действия версена и трипсина монослой следует промыть средой Игла, после чего налить 5 мл среды роста для получения взвеси и разделить ее в новые матрасы, стерильно добавить среду роста, закрыть, поставить дату, номер пассирования и инкубировать в термостате при температуре 37 °С до получения монослоя.

Перед инокуляцией клинического материала и окрашивания образца для микроскопии следует приготовить циклогексимид (ЦГ); порошок ЦГ хранят сухим при температуре 4 °С. Перед использованием готовят раствор ЦГ на изолирующей среде в концентрации 2 мкг/мл (препарат токсичен).

Приготовление плоскодонных пробирок и покровных стекол для заражения клинического материала от больных. В стерильные плоскодонные пробирки с помещенными в иих покровными стеклами добавляют по 2 мл клеточной суспензии. Предварительно в камере Горяева (или в гемоцитометре) подсчитывают количество клеток в 1 мл среды (примерно lxlO5 в 1 мл суспензии). Затем плоскодонные пробирки с клетками помещают в термостат при температуре 37 °С на 16—24 ч.

Для добавления клинического материала в плоскодонные пробирки с монослоем помечают пробирки (по две на каждого больного). Пенициллиновые флаконы с транспортной средой, содержащей клинический материал, энергично встряхивают в течение 30 с механически или на магнитной мешалке. Затем во флаконы добавляют 2 мл свежеприготовленной изолирующей среды. В это же время из пробирок с монослоем пастеровской пипеткой отсасывают среду роста (не разрушая монослоя). Затем распределяют изолирующую среду из пробирок с инфекционным материалом приблизительно по 2 мл в каждую плоскодонную пробирку с монослоем и центрифугируют их в течение часа при 3000 об/мин в центрифуге с горизонтальным ротором. Инкубируют в термостате при температуре 37 °С 2 ч, затем отсасывают изолирующую среду и добавляют по 2 мл новой порции изолирующей среды, содержащей ЦГ (2 мкг/мл).

Материал инкубируют в термостате при температуре 37 °С 48— 72 ч. Перед фиксацией и окраской по Романовскому — Гимзе монослоя клеток Мак-Коя удаляют среду из пробирок, не нарушая монослоя, и добавляют 1—2 мл метанола осторожно по стенке, фиксируют в течение 10 мин, осторожно потряхивая пробирку для ресуспензирования белкового осадка, промывают фосфатным буфером (рН 6,8). Необходимо приготовить краску по Романовскому — Гимзе на фосфатном буфере рН 6,8:10 (1 часть краски и 9 частей фосфатного буфера). Затем приливают по 1 мл краски в каждую пробирку, через 30—60 мин удаляют ее и дифференцируют препарат 30% метанолом на фосфатном буфере, высушивают стекла. Монтируют на предметное стекло (толщиной 0,8—1,0 мм) покровные стекла монослоем вниз в канадский бальзам.

Просматривают в темнопольном микроскопе на присутствие включений при увеличении в 400 или 600 раз. В темном поле включения хламидии дают желто-зеленую флюоресценцию. В сомнительных случаях рекомендуется исследовать в световом микроскопе под иммерсией с объективом 90. Элементарные тельца хламидии имеют розовый, а ретикулярные — синий цвет.

УРОГЕНИТАЛЬНЫЙ УРЕАПЛАЗМОЗ

Ureaplasma urealyticum, относится к прокариотам, классу Mollicutes (от mollis — мягкий, cutes — кожа), порядку Т — Mycoplasmatales, семейству Mycoplasmataceae, роду Ur. urealyticum.

Впервые Т-штаммы выделил от больного с негонококковым уретритом М. Shepard (1954). Он же описал их отличительную морфологию и дал культуральную характеристику. Название Ur. urealyticum предложено М; Shepard и соавт. в 1974 г., когда ими была обнаружена уреазная активность Т-штаммов микоплазм.

Особенности тонкого строения и способа репродукции изучены недостаточно. В то же время без знания ультраструктурных особ

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Скачать книгу "Кожные и венерические болезни. Руководство для врачей. Том 4" (5.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]


Химический каталог Rambler's Top100

Copyright © 2009
(10.12.2018)